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血清、血浆、尿液、粪便代谢组学样本收集参考步骤

1.血清(Serum

样品量要求:NMR 实验 500 uL/sample

GC-MSLC-MS 实验 200 uL/sample

注意:一定避免反复冻融。

样本收集步骤:

血液收集在离心管中 37 (或室温)静置 1 h 进行凝固分层。然后 3000 rpm 室温离心取上清转至干净的离心管中。再12000 rpm 4 离心10 min,取上清分装到1.5 mL离心管中,每管0.2 mL-80 冰箱冻存。足量干冰寄送。

注意事项:

1)取血时如用酒精消毒,请擦干擦拭部位,待酒精完全挥发后再取样。

2)取血时如用麻醉剂,建议用异氟醚,防止在NMR血清谱图中出现干扰峰。

3)血清参考产率:30%~50%(例如:1 mL 全血大约能得 0.3~0.5 mL血清)。

4)采全血时如使用真空采血管,请务必使用无预加抗凝剂的凝血管。

5)强烈推荐尽量多的收集样本并分装冻存(这样可以用于多个实验,且避免反复冻融)。

2.血浆(Plasma)

样品量要求

NMR 实验 500 uL/sample

GC-MSLC-MS实验 200 uL/sample

注意:一定避免反复冻融。

样本收集步骤:

应使用肝素钠抗凝管采集全血,并尽快进行血浆分离:3000 rpm室温离心10 min,取上层,0.2 mL/管分装至1.5 mL离心管中。-80 冰箱冻存。足量干冰寄送。

注意事项:

1)对于抗凝管的选择:代谢组学实验检测推荐使用肝素钠抗凝管(因为柠檬酸是TCA 循环中的重要物质,使用柠檬酸钠抗凝剂会引入外源污染。而EDTA会影响NMR 采谱。但肝素钠会对 RNA 相关实验有负面作用,主要是因为会抑制反转录酶活性。请根据自身具体情况选用合适的抗凝管)。

2)最后分装保存推荐使用1.5 mL离心管,因为螺口冻存管管帽内有一个橡胶垫圈,目的是为了密封。但是长期在-80 干冰低温下,橡胶圈会变硬脆,易脱落,导致密封不严,样本泄露。

3)血浆参考产率:≈50%(例如1 mL全血大约能得0.5mL血浆)。

3.粪便(Faeces)

样品量要求:

200 mg/sample,一定避免反复冻融。

样本收集步骤:

收集到新鲜粪便或肠道内容物样本后,添加一滴(约10 uL)质量体积比为1/100

w/v)的叠氮化钠,分装样本200 mg/管,然后立即用液氮速冻处理15 min,保存至-80冰箱,足量干冰寄送。

注意事项:

1)叠氮化钠的作用是防腐杀菌,有毒,请万分小心;

2)由于粪便/肠道内容物中有非常多的微生物,微生物代谢速度非常快,所以反复冻融会对代谢水平有非常大影响。强烈建议样本收集后,按照200 mg/sample进行分装冻存。

4.尿液(Urine)

样品量要求:

1mL/例,原则上可以多取一点。

样本收集步骤:

晨起中段尿(临床)或晨间 1h 尿(动物)直接分装到离心管中,每管1mL,添加质量体积为0.5/1000w/v)的叠氮化钠,-80 冰箱冻存,足量干冰寄送。

注意事项:

1)动物 1h 尿量不够,可分多次收集,如果需要收取24 h尿液,请使用带有低温装置的代谢笼收取,并添加叠氮化钠;

2)叠氮化钠的作用是防腐杀菌,有毒,请万分小心。

 

样品运送方式:干冰寄送(以每天消耗5kg的量计)

参考文献:

Wu J, An Y, Yao J, et al. An optimised sample preparation method for NMR-based faecal metabonomic analysis.[J]. Analyst, 2010, 135(5): 1023-30.

Beckonert O, Keun H C, Ebbels T M D, et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine,  plasma, serum  and  tissue extracts.[J]. Nature Protocol, 2007, 2(11): 2692-703.